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Microscope utilisant la lumière visible

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Les microscope optique, également appelé microscope optique, est un type de microscope qui utilise couramment la lumière visible et un système de lentilles pour générer des images agrandies de petits objets. Les microscopes optiques sont la conception la plus ancienne de microscope et ont peut-être été inventés sous leur forme composée actuelle au 17ème siècle. Les microscopes optiques de base peuvent être très simples, bien que de nombreuses conceptions complexes visent à améliorer la résolution et le contraste de l’échantillon.

L’objet est placé sur un organiser et peut être vu directement à travers un ou deux oculaires sur le microscope. Dans les microscopes à haute puissance, les deux oculaires montrent généralement la même image, mais avec un stéréomicroscope, des images légèrement différentes sont utilisées pour créer un effet 3D. Une caméra est généralement utilisée pour capturer l’image (micrographie).

L’échantillon peut être éclairé de différentes manières. Les objets transparents peuvent être éclairés par le bas et les objets solides peuvent être éclairés par la lumière traversant (champ clair) ou autour (champ sombre) de la lentille de l’objectif. La lumière polarisée peut être utilisée pour déterminer l’orientation des cristaux d’objets métalliques. L’imagerie en contraste de phase peut être utilisée pour augmenter le contraste de l’image en mettant en évidence de petits détails d’indice de réfraction différent.

Une gamme d’objectifs avec différents grossissements sont généralement fournis montés sur une tourelle, leur permettant d’être mis en place et offrant une capacité de zoom avant. Le pouvoir de grossissement maximal des microscopes optiques est généralement limité à environ 1000x en raison du pouvoir de résolution limité de la lumière visible. Le grossissement d’un microscope optique composé est le produit du grossissement de l’oculaire (disons 10x) et de l’objectif (disons 100x), pour donner un grossissement total de 1 000×. Les environnements modifiés tels que l’utilisation d’huile ou de lumière ultraviolette peuvent augmenter le grossissement.

Les alternatives à la microscopie optique qui n’utilisent pas la lumière visible comprennent la microscopie électronique à balayage et la microscopie électronique à transmission et la microscopie à sonde à balayage et, par conséquent, peuvent atteindre des grossissements beaucoup plus importants.

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Schéma d’un microscope simple

Il existe deux types de base de microscopes optiques : les microscopes simples et les microscopes composés. Un microscope simple utilise la puissance optique d’une seule lentille ou d’un groupe de lentilles pour le grossissement. Un microscope composé utilise un système de lentilles (un ensemble agrandissant l’image produite par un autre) pour obtenir un grossissement beaucoup plus élevé d’un objet. La grande majorité des microscopes de recherche modernes sont des microscopes composés, tandis que certains microscopes numériques commerciaux moins chers sont de simples microscopes à lentille unique. Les microscopes composés peuvent être divisés en une variété d’autres types de microscopes qui diffèrent par leurs configurations optiques, leur coût et leurs objectifs.

Microscope simple[[[[Éditer]

Un simple microscope utilise une lentille ou un ensemble de lentilles pour agrandir un objet par le seul grossissement angulaire, donnant au spectateur une image virtuelle agrandie dressée.[1][2] L’utilisation d’une seule lentille convexe ou de groupes de lentilles se retrouve dans des appareils de grossissement simples tels que la loupe, les loupes et les oculaires pour télescopes et microscopes.

Microscope composé[[[[Éditer]

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Schéma d’un microscope composé

Un microscope composé utilise une lentille proche de l’objet observé pour collecter la lumière (appelée lentille d’objectif) qui focalise une image réelle de l’objet à l’intérieur du microscope (image 1). Cette image est ensuite agrandie par une deuxième lentille ou groupe de lentilles (appelée oculaire) qui donne au spectateur une image virtuelle inversée agrandie de l’objet (image 2).[3] L’utilisation d’une combinaison objectif/oculaire permet un grossissement beaucoup plus élevé. Les microscopes composés courants comportent souvent des lentilles d’objectif interchangeables, permettant à l’utilisateur d’ajuster rapidement le grossissement.[3] Un microscope composé permet également des configurations d’éclairage plus avancées, telles que le contraste de phase.

Autres variantes de microscopes[[[[Éditer]

Il existe de nombreuses variantes de la conception du microscope optique composé à des fins spécialisées. Certaines d’entre elles sont des différences de conception physiques permettant une spécialisation à certaines fins :

  • Microscope stéréo, un microscope de faible puissance qui fournit une vue stéréoscopique de l’échantillon, couramment utilisé pour la dissection.
  • Microscope de comparaison, qui a deux chemins lumineux séparés permettant la comparaison directe de deux échantillons via une image dans chaque œil.
  • Microscope inversé, pour l’étude d’échantillons par le bas ; utile pour les cultures cellulaires en liquide, ou pour la métallographie.
  • Microscope d’inspection des connecteurs à fibre optique, conçu pour l’inspection des extrémités des connecteurs
  • Microscope de voyage, pour l’étude d’échantillons à haute résolution optique.

D’autres variantes de microscope sont conçues pour différentes techniques d’éclairage :

  • Microscope pétrographique, dont la conception comprend généralement un filtre polarisant, une platine rotative et une plaque de gypse pour faciliter l’étude des minéraux ou d’autres matériaux cristallins dont les propriétés optiques peuvent varier avec l’orientation.
  • Microscope polarisant, similaire au microscope pétrographique.
  • Microscope à contraste de phase, qui applique la méthode d’éclairage à contraste de phase.
  • Microscope à épifluorescence, conçu pour l’analyse d’échantillons contenant des fluorophores.
  • Microscope confocal, une variante largement utilisée de l’éclairage épifluorescent qui utilise un laser à balayage pour éclairer un échantillon pour la fluorescence.
  • Microscope à deux photons, utilisé pour imager la fluorescence plus profondément dans les milieux de diffusion et réduire le photoblanchiment, en particulier dans les échantillons vivants.
  • Microscope étudiant – un microscope souvent de faible puissance avec des commandes simplifiées et une optique parfois de mauvaise qualité conçu pour une utilisation scolaire ou comme instrument de démarrage pour les enfants.[4]
  • Ultramicroscope, un microscope optique adapté qui utilise la diffusion de la lumière pour permettre la visualisation de minuscules particules dont le diamètre est inférieur ou proche de la longueur d’onde de la lumière visible (environ 500 nanomètres); pour la plupart obsolètes depuis l’avènement des microscopes électroniques
  • Le microscope Raman à pointe améliorée est une variante du microscope optique basée sur la spectroscopie Raman à pointe améliorée, sans limites de résolution traditionnelles basées sur la longueur d’onde.[5][6] Ce microscope réalisé principalement sur les plateformes de microscopes à sonde à balayage utilisant tous les outils optiques.

Microscope numérique[[[[Éditer]

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Un microscope numérique est un microscope équipé d’une caméra numérique permettant l’observation d’un échantillon via un ordinateur. Les microscopes peuvent également être partiellement ou totalement contrôlés par ordinateur avec différents niveaux d’automatisation. La microscopie numérique permet une meilleure analyse d’une image de microscope, par exemple, des mesures de distances et de surfaces et la quantification d’une coloration fluorescente ou histologique.

Des microscopes numériques de faible puissance, des microscopes USB, sont également disponibles dans le commerce. Il s’agit essentiellement de webcams avec un objectif macro haute puissance et n’utilisent généralement pas de transillumination. L’appareil photo se connecte directement au port USB d’un ordinateur afin que les images s’affichent directement sur le moniteur. Ils offrent des grossissements modestes (jusqu’à environ 200x) sans avoir besoin d’utiliser des oculaires, et à très faible coût. L’éclairage à haute puissance est généralement fourni par une ou des sources LED adjacentes à l’objectif de la caméra.

La microscopie numérique avec de très faibles niveaux de lumière pour éviter d’endommager les échantillons biologiques vulnérables est disponible à l’aide d’appareils photo numériques sensibles à comptage de photons. Il a été démontré qu’une source lumineuse fournissant des paires de photons intriqués peut minimiser le risque d’endommager les échantillons les plus sensibles à la lumière. Dans cette application de l’imagerie fantôme à la microscopie à photons clairsemés, l’échantillon est éclairé par des photons infrarouges, dont chacun est spatialement corrélé avec un partenaire intriqué dans la bande visible pour une imagerie efficace par une caméra à comptage de photons.[7]

Histoire[[[[Éditer]

Invention[[[[Éditer]

Les premiers microscopes étaient des loupes à lentille unique avec un grossissement limité qui remontent au moins à l’utilisation généralisée des lentilles dans les lunettes au 13ème siècle.[8]

Les microscopes composés sont apparus pour la première fois en Europe vers 1620[9][10] dont une démontrée par Cornelis Drebbel à Londres (vers 1621) et une exposée à Rome en 1624.[11][12]

Le véritable inventeur du microscope composé est inconnu, bien que de nombreuses affirmations aient été faites au fil des ans. Il s’agit notamment d’une revendication 35[13] des années après qu’ils soient apparus par le fabricant de lunettes hollandais Johannes Zachariassen que son père, Zacharias Janssen, a inventé le microscope composé et/ou le télescope dès 1590. Johannes (certains prétendent douteux)[14][15][16] Le témoignage repousse la date de l’invention si loin que Zacharias aurait été un enfant à l’époque, ce qui laisse supposer que, pour que l’affirmation de Johannes soit vraie, le microscope composé aurait dû être inventé par le grand-père de Johannes, Hans Martens.[17] Une autre affirmation est que le concurrent de Janssen, Hans Lippershey (qui a déposé le premier brevet de télescope en 1608) a également inventé le microscope composé.[18] D’autres historiens citent l’innovateur néerlandais Cornelis Drebbel avec son microscope composé de 1621.[11][12]

Galileo Galilei est aussi parfois cité comme inventeur du microscope composé. Après 1610, il a découvert qu’il pouvait fermer la mise au point de son télescope pour voir de petits objets, tels que des mouches, de près[19] et/ou pourrait regarder à travers le mauvais côté à l’envers pour agrandir les petits objets.[20] Le seul inconvénient était que son télescope de 2 pieds de long devait être étendu à 6 pieds pour voir les objets qui se ferment.[21] Après avoir vu le microscope composé construit par Drebbel exposé à Rome en 1624, Galilée a construit sa propre version améliorée.[11][12] En 1625, Giovanni Faber invente le nom microscope pour le microscope composé Galileo soumis à l’Accademia dei Lincei en 1624 [22] (Galileo l’avait appelé le « occhiolino » ou « petit oeil« ). Faber a inventé le nom des mots grecs ?? (micron) signifiant « petit », et ?? (skopein) signifiant « regarder », un nom censé être analogue à « télescope », un autre mot inventé par les Linceans.[23]

Christiaan Huygens, un autre Hollandais, a développé un système oculaire simple à 2 lentilles à la fin du 17ème siècle qui a été corrigé achromatiquement, et donc un énorme pas en avant dans le développement du microscope. L’oculaire Huygens est toujours produit à ce jour, mais souffre d’une petite taille de champ et d’autres inconvénients mineurs.

Vulgarisation[[[[Éditer]

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Antonie van Leeuwenhoek (1632-1724) est crédité d’avoir porté le microscope à l’attention des biologistes, même si de simples lentilles grossissantes étaient déjà produites au 16ème siècle. Les microscopes faits maison par Van Leeuwenhoek étaient de simples microscopes, avec une seule lentille très petite mais puissante. Ils étaient difficiles à utiliser, mais permettaient à van Leeuwenhoek de voir des images détaillées. Il a fallu environ 150 ans de développement optique avant que le microscope composé soit capable de fournir la même qualité d’image que les microscopes simples de van Leeuwenhoek, en raison des difficultés de configuration de plusieurs lentilles. Dans les années 1850, John Leonard Riddell, professeur de chimie à l’Université de Tulane, a inventé le premier microscope binoculaire pratique tout en menant l’une des premières et des plus vastes investigations microscopiques américaines sur le choléra.[25][26]

Techniques d’éclairage[[[[Éditer]

Alors que la technologie de base des microscopes et l’optique sont disponibles depuis plus de 400 ans, c’est beaucoup plus récemment que des techniques d’éclairage d’échantillons ont été développées pour générer les images de haute qualité vues aujourd’hui.

En août 1893, August Köhler développa l’éclairage Köhler. Cette méthode d’éclairage d’échantillon donne lieu à un éclairage extrêmement uniforme et surmonte de nombreuses limitations des anciennes techniques d’éclairage d’échantillon. Avant le développement de l’éclairage de Köhler, l’image de la source lumineuse, par exemple un filament d’ampoule, était toujours visible dans l’image de l’échantillon.

Le prix Nobel de physique a été décerné au physicien néerlandais Frits Zernike en 1953 pour son développement de l’éclairage à contraste de phase qui permet l’imagerie d’échantillons transparents. En utilisant l’interférence plutôt que l’absorption de la lumière, des échantillons extrêmement transparents, tels que des cellules de mammifères vivants, peuvent être imagés sans avoir à utiliser de techniques de coloration. Deux ans plus tard, en 1955, Georges Nomarski publiait la théorie de la microscopie différentielle à contraste interférentiel, une autre technique d’imagerie basée sur les interférences.

Microscopie à fluorescence[[[[Éditer]

La microscopie biologique moderne dépend fortement du développement de sondes fluorescentes pour des structures spécifiques au sein d’une cellule. Contrairement à la microscopie optique transilluminée normale, en microscopie à fluorescence, l’échantillon est éclairé à travers la lentille de l’objectif avec un ensemble étroit de longueurs d’onde de lumière. Cette lumière interagit avec les fluorophores dans l’échantillon qui émettent alors une lumière d’une longueur d’onde plus longue. C’est cette lumière émise qui constitue l’image.

Depuis le milieu du 20e siècle, des colorants chimiques fluorescents, tels que le DAPI qui se lie à l’ADN, ont été utilisés pour marquer des structures spécifiques au sein de la cellule. Les développements plus récents incluent l’immunofluorescence, qui utilise des anticorps marqués par fluorescence pour reconnaître des protéines spécifiques dans un échantillon, et des protéines fluorescentes comme la GFP qu’une cellule vivante peut exprimer, ce qui la rend fluorescente.

Composants[[[[Éditer]

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Éléments de base du microscope à transmission optique (années 1990)

Tous les microscopes optiques modernes conçus pour visualiser des échantillons par lumière transmise partagent les mêmes composants de base du trajet optique. De plus, la grande majorité des microscopes ont les mêmes composants « structurels »[27] (numérotés ci-dessous selon l’image de droite) :

  • Oculaire (lentille oculaire) (1)
  • Tourelle d’objectif, revolver ou tourelle nasale (pour contenir plusieurs objectifs) (2)
  • Lentilles d’objectif (3)
  • Boutons de mise au point (pour déplacer la scène)
    • Réglage grossier (4)
    • Réglage fin (5)
  • Scène (pour tenir le spécimen) (6)
  • Source lumineuse (une lumière ou un miroir) (7)
  • Diaphragme et condenseur (8)
  • Platine mécanique (9)

Oculaire (lentille oculaire)[[[[Éditer]

L’oculaire, ou lentille oculaire, est un cylindre contenant deux lentilles ou plus ; sa fonction est de mettre l’image au point pour l’œil. L’oculaire est inséré dans l’extrémité supérieure du tube du corps. Les oculaires sont interchangeables et de nombreux oculaires différents peuvent être insérés avec différents degrés de grossissement. Les valeurs de grossissement typiques pour les oculaires incluent 5×, 10× (le plus courant), 15× et 20×. Dans certains microscopes hautes performances, la configuration optique de l’objectif et de l’oculaire est adaptée pour offrir les meilleures performances optiques possibles. Cela se produit le plus souvent avec des objectifs apochromatiques.

Tourelle d’objectif (revolver ou porte-nez tournant)[[[[Éditer]

La tourelle d’objectif, le revolver ou le nez rotatif est la partie qui contient l’ensemble de lentilles d’objectif. Il permet à l’utilisateur de basculer entre les objectifs.

Objectif[[[[Éditer]

À l’extrémité inférieure d’un microscope optique composé typique, il y a une ou plusieurs lentilles d’objectif qui collectent la lumière de l’échantillon. L’objectif se trouve généralement dans un boîtier cylindrique contenant une lentille composite en verre à un ou plusieurs éléments. En règle générale, il y aura environ trois objectifs vissés dans un nez circulaire qui peut être tourné pour sélectionner l’objectif requis. Ces dispositions sont conçues pour être parfocales, ce qui signifie que lorsque l’on passe d’un objectif à l’autre sur un microscope, l’échantillon reste net. Les objectifs de microscope sont caractérisés par deux paramètres, à savoir le grossissement et l’ouverture numérique. Le premier va typiquement de 5x à 100x tandis que le dernier va de 0,14 à 0,7, correspondant à des distances focales d’environ 40 à 2 mm, respectivement. Les objectifs avec des grossissements plus élevés ont normalement une ouverture numérique plus élevée et une profondeur de champ plus courte dans l’image résultante. Certains objectifs haute performance peuvent nécessiter des oculaires adaptés pour offrir les meilleures performances optiques.

Objectif à immersion d’huile[[[[Éditer]

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Deux objectifs de microscope à immersion dans l’huile Leica : 100× (à gauche) et 40× (à droite)

Certains microscopes utilisent des objectifs à immersion dans l’huile ou dans l’eau pour une meilleure résolution à fort grossissement. Ceux-ci sont utilisés avec un matériau d’indexation tel que de l’huile d’immersion ou de l’eau et une lamelle assortie entre la lentille de l’objectif et l’échantillon. L’indice de réfraction du matériau correspondant à l’indice est supérieur à celui de l’air, ce qui permet à l’objectif d’avoir une plus grande ouverture numérique (supérieure à 1) afin que la lumière soit transmise de l’échantillon à la face externe de l’objectif avec une réfraction minimale. Des ouvertures numériques aussi élevées que 1,6 peuvent être atteintes.[28] La plus grande ouverture numérique permet de collecter plus de lumière, ce qui permet une observation détaillée de plus petits détails. Une lentille à immersion dans l’huile a généralement un grossissement de 40 à 100×.

Boutons de mise au point[[[[Éditer]

Les boutons de réglage déplacent la scène de haut en bas avec un réglage séparé pour une mise au point grossière et fine. Les mêmes commandes permettent au microscope de s’adapter à des spécimens d’épaisseur différente. Dans les anciennes conceptions de microscopes, les molettes de réglage de la mise au point déplacent le tube du microscope vers le haut ou vers le bas par rapport au support et avaient une platine fixe.

Cadre[[[[Éditer]

L’ensemble de l’ensemble optique est traditionnellement attaché à un bras rigide, lui-même attaché à un pied robuste en forme de U pour fournir la rigidité nécessaire. L’angle du bras peut être réglable pour permettre d’ajuster l’angle de vision.

Le cadre fournit un point de montage pour diverses commandes de microscope. Normalement, cela inclura des commandes de mise au point, généralement une grande molette pour régler la mise au point grossière, ainsi qu’une plus petite molette pour contrôler la mise au point fine. D’autres caractéristiques peuvent être des commandes de lampe et/ou des commandes de réglage du condenseur.

Organiser[[[[Éditer]

La scène est une plate-forme sous la lentille de l’objectif qui supporte le spécimen en cours de visualisation. Au centre de la scène se trouve un trou par lequel passe la lumière pour éclairer le spécimen. La platine a généralement des bras pour contenir des lames (plaques de verre rectangulaires avec des dimensions typiques de 25 × 75 mm, sur lesquelles le spécimen est monté).

À des grossissements supérieurs à 100×, déplacer une lame à la main n’est pas pratique. Une platine mécanique, typique des microscopes à prix moyen et supérieur, permet de minuscules mouvements de la lame via des boutons de commande qui repositionnent l’échantillon/la lame comme vous le souhaitez. Si un microscope n’avait pas à l’origine de platine mécanique, il peut être possible d’en ajouter une.

Toutes les étapes montent et descendent pour se concentrer. Avec une platine mécanique, les glissières se déplacent sur deux axes horizontaux pour positionner l’échantillon afin d’examiner les détails de l’échantillon.

La mise au point commence à un grossissement inférieur afin de centrer l’échantillon par l’utilisateur sur la scène. Le passage à un grossissement plus élevé nécessite que la platine soit déplacée plus haut verticalement pour une nouvelle mise au point à un grossissement plus élevé et peut également nécessiter un léger ajustement horizontal de la position de l’échantillon. Les ajustements horizontaux de la position de l’échantillon sont la raison d’avoir une platine mécanique.

En raison de la difficulté de préparer les échantillons et de les monter sur des lames, il est préférable pour les enfants de commencer avec des lames préparées qui sont centrées et se concentrent facilement quel que soit le niveau de mise au point utilisé.

Source de lumière[[[[Éditer]

De nombreuses sources de lumière peuvent être utilisées. Dans sa forme la plus simple, la lumière du jour est dirigée via un miroir. La plupart des microscopes, cependant, ont leur propre source lumineuse réglable et contrôlable – souvent une lampe halogène, bien que l’éclairage utilisant des LED et des lasers soit de plus en plus courant. L’éclairage de Köhler est souvent fourni sur des instruments plus chers.

Condenseur[[[[Éditer]

Le condenseur est une lentille conçue pour focaliser la lumière de la source d’éclairage sur l’échantillon. Le condenseur peut également comporter d’autres fonctionnalités, telles qu’un diaphragme et/ou des filtres, pour gérer la qualité et l’intensité de l’éclairage. Pour les techniques d’éclairage telles que la microscopie à fond noir, à contraste de phase et à contraste d’interférence différentielle, des composants optiques supplémentaires doivent être alignés avec précision dans le trajet lumineux.

Grossissement[[[[Éditer]

La puissance réelle ou le grossissement d’un microscope optique composé est le produit des puissances de l’oculaire (oculaire) et de l’objectif. Les grossissements normaux maximum de l’oculaire et de l’objectif sont respectivement de 10× et 100×, ce qui donne un grossissement final de 1 000×.

Grossissement et micrographies[[[[Éditer]

Lors de l’utilisation d’un appareil photo pour capturer une micrographie, le grossissement effectif de l’image doit tenir compte de la taille de l’image. Ceci est indépendant du fait qu’il s’agisse d’une copie d’un négatif de film ou d’un affichage numérique sur un écran d’ordinateur.

Dans le cas des appareils photographiques à pellicule, le calcul est simple ; le grossissement final est le produit de : le grossissement de l’objectif, le grossissement de l’optique de la caméra et le facteur d’agrandissement du tirage du film par rapport au négatif. Une valeur typique du facteur d’agrandissement est d’environ 5× (pour le cas d’un film de 35 mm et d’une impression de 15 × 10 cm (6 × 4 pouces)).

Dans le cas des appareils photo numériques, la taille des pixels dans le détecteur CMOS ou CCD et la taille des pixels sur l’écran doivent être connues. Le facteur d’agrandissement du détecteur aux pixels à l’écran peut alors être calculé. Comme pour un appareil photo argentique, le grossissement final est le produit : du grossissement de l’objectif, du grossissement de l’optique de la caméra et du facteur d’agrandissement.

Opération[[[[Éditer]

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Techniques d’éclairage[[[[Éditer]

De nombreuses techniques sont disponibles qui modifient le chemin lumineux pour générer une image de contraste améliorée à partir d’un échantillon. Les principales techniques pour générer un contraste accru à partir de l’échantillon comprennent la lumière à polarisation croisée, le champ sombre, le contraste de phase et l’éclairage par contraste interférentiel différentiel. Une technique récente (Sarfus) combine une lumière à polarisation croisée et des lames spécifiques à contraste amélioré pour la visualisation d’échantillons nanométriques.

Autres techniques[[[[Éditer]

Les microscopes modernes permettent plus qu’une simple observation de l’image en lumière transmise d’un échantillon ; il existe de nombreuses techniques qui peuvent être utilisées pour extraire d’autres types de données. La plupart d’entre eux nécessitent un équipement supplémentaire en plus d’un microscope composé de base.

  • Lumière réfléchie, ou éclairage incident (pour l’analyse des structures de surface)
  • Microscopie à fluorescence, les deux :
  • Microspectroscopie (où un spectrophotomètre UV-visible est intégré à un microscope optique)
  • Microscopie ultraviolette
  • Microscopie proche infrarouge
  • Microscopie à transmission multiple[29] pour l’amélioration du contraste et la réduction des aberrations.
  • Automatisation (pour la numérisation automatique d’un grand échantillon ou la capture d’images)

Applications[[[[Éditer]

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Une image de grossissement 40x de cellules dans un test de frottis médical prise au microscope optique en utilisant une technique de montage humide, en plaçant l’échantillon sur une lame de verre et en le mélangeant avec une solution saline

La microscopie optique est largement utilisée en microélectronique, nanophysique, biotechnologie, recherche pharmaceutique, minéralogie et microbiologie.[30]

La microscopie optique est utilisée pour le diagnostic médical, le domaine étant appelé histopathologie lorsqu’il s’agit de tissus, ou dans les tests de frottis sur des cellules libres ou des fragments de tissus.

Dans l’utilisation industrielle, les microscopes binoculaires sont courants. Outre les applications nécessitant une véritable perception de la profondeur, l’utilisation d’oculaires doubles réduit la fatigue oculaire associée aux longues journées de travail dans une station de microscopie. Dans certaines applications, les microscopes à longue distance de travail ou à longue focale[31] sont bénéfiques. Un élément peut devoir être examiné derrière une fenêtre, ou des sujets industriels peuvent constituer un danger pour l’objectif. De telles optiques ressemblent à des télescopes dotés de capacités de mise au point rapprochée.[32][33]

Les microscopes de mesure sont utilisés pour des mesures de précision. Il existe deux types de base.
L’un possède un réticule gradué pour permettre de mesurer des distances dans le plan focal.[34] L’autre type (et plus ancien) a de simples réticules et un mécanisme micrométrique pour déplacer le sujet par rapport au microscope.[35]

De très petits microscopes portables ont trouvé une certaine utilisation dans des endroits où un microscope de laboratoire serait un fardeau.[36]

Limites[[[[Éditer]

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La limite de diffraction gravée dans la pierre sur un monument pour Ernst Abbe.

À des grossissements très élevés avec la lumière transmise, les objets ponctuels sont considérés comme des disques flous entourés d’anneaux de diffraction. Ceux-ci sont appelés disques Airy. Les pouvoir de résolution d’un microscope est considérée comme la capacité de distinguer deux disques d’Airy étroitement espacés (ou, en d’autres termes, la capacité du microscope à révéler des détails structurels adjacents comme distincts et séparés). Ce sont ces impacts de diffraction qui limitent la capacité de résoudre des détails fins. L’étendue et l’amplitude des diagrammes de diffraction sont affectées à la fois par la longueur d’onde de la lumière (λ), les matériaux de réfraction utilisés pour fabriquer la lentille d’objectif et l’ouverture numérique (NA) de la lentille d’objectif. Il existe donc une limite finie au-delà de laquelle il est impossible de résoudre des points séparés dans le champ objectif, dite limite de diffraction. En supposant que les aberrations optiques dans l’ensemble du montage optique soient négligeables, la résolution , peut s’énoncer comme :

Habituellement, une longueur d’onde de 550 nm est supposée, ce qui correspond à la lumière verte. Avec l’air comme milieu externe, le plus pratique N / A est de 0,95, et avec de l’huile, jusqu’à 1,5. En pratique, la valeur la plus faible de pouvant être obtenu avec des lentilles conventionnelles est d’environ 200 nm. Un nouveau type d’objectif utilisant la diffusion multiple de la lumière a permis d’améliorer la résolution en dessous de 100 nm.[37]

Dépasser la limite de résolution[[[[Éditer]

De multiples techniques sont disponibles pour atteindre des résolutions supérieures à la limite de lumière transmise décrite ci-dessus. Les techniques holographiques, telles que décrites par Courjon et Bulabois en 1979, sont également capables de briser cette limite de résolution, bien que la résolution ait été restreinte dans leur analyse expérimentale.[38]

En utilisant des échantillons fluorescents, d’autres techniques sont disponibles. Les exemples incluent Vertico SMI, la microscopie optique à balayage en champ proche qui utilise des ondes évanescentes et l’appauvrissement des émissions stimulées. En 2005, un microscope capable de détecter une seule molécule a été décrit comme un outil pédagogique.[39]

Malgré des progrès importants au cours de la dernière décennie, les techniques de dépassement de la limite de diffraction restent limitées et spécialisées.

Alors que la plupart des techniques se concentrent sur l’augmentation de la résolution latérale, certaines techniques visent également à permettre l’analyse d’échantillons extrêmement minces. Par exemple, les méthodes sarfus placent l’échantillon mince sur une surface améliorant le contraste et permettent ainsi de visualiser directement des films aussi minces que 0,3 nanomètre.

Le 8 octobre 2014, le prix Nobel de chimie a été décerné à Eric Betzig, William Moerner et Stefan Hell pour le développement de la microscopie à fluorescence super-résolue.[40][41]

Éclairage structuré SMI[[[[Éditer]

La SMI (microscopie d’éclairage à modulation spatiale) est un processus optique léger de l’ingénierie dite de la fonction d’étalement de point (PSF). Il s’agit de processus qui modifient la PSF d’un microscope de manière appropriée pour soit augmenter la résolution optique, soit maximiser la précision des mesures de distance d’objets fluorescents petits par rapport à la longueur d’onde de la lumière d’éclairage, soit extraire d’autres paramètres structurels dans la gamme nanométrique.[42][43]

Microscopie de localisation SPDMphymod[[[[Éditer]

Cremer de microscopie 3D bicolore à super résolution de 2010

Microscopie 3D bicolore super résolution avec Her2 et Her3 dans les cellules mammaires, colorants standard : Alexa 488, Alexa 568 LIMON

SPDM (microscopie à distance de précision spectrale), la technologie de base de la microscopie de localisation est un procédé optique léger de microscopie à fluorescence qui permet des mesures de position, de distance et d’angle sur des particules « optiquement isolées » (par exemple des molécules) bien en dessous de la limite théorique de résolution pour la microscopie optique. « Optiquement isolé » signifie qu’à un moment donné, seule une seule particule/molécule dans une région d’une taille déterminée par une résolution optique conventionnelle (généralement d’environ 200 à 250 nm de diamètre) est enregistrée. Cela est possible lorsque les molécules d’une telle région portent toutes des marqueurs spectraux différents (par exemple, différentes couleurs ou d’autres différences utilisables dans l’émission lumineuse de différentes particules).[44][45][46][47]

De nombreux colorants fluorescents standard tels que GFP, colorants Alexa, colorants Atto, Cy2/Cy3 et molécules de fluorescéine peuvent être utilisés pour la microscopie de localisation, à condition que certaines conditions photophysiques soient présentes. En utilisant cette technologie dite SPDMphymod (fluorophores physiquement modifiables), une seule longueur d’onde laser d’intensité appropriée est suffisante pour la nano-imagerie.[48]

Microscopie 3D super résolution[[[[Éditer]

La microscopie à super résolution 3D avec des colorants fluorescents standard peut être réalisée en combinant la microscopie de localisation pour les colorants fluorescents standard SPDMphymod et l’éclairage structuré SMI.[49]

STED[[[[Éditer]

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Image de microscopie à déplétion par émission stimulée (STED) de filaments d’actine dans une cellule.

L’appauvrissement par émission stimulée est un exemple simple de la façon dont une résolution supérieure dépassant la limite de diffraction est possible, mais elle a des limitations majeures. STED est une technique de microscopie à fluorescence qui utilise une combinaison d’impulsions lumineuses pour induire la fluorescence dans une petite sous-population de molécules fluorescentes dans un échantillon. Chaque molécule produit une tache de lumière à diffraction limitée dans l’image, et le centre de chacune de ces taches correspond à l’emplacement de la molécule. Comme le nombre de molécules fluorescentes est faible, il est peu probable que les points lumineux se chevauchent et peuvent donc être placés avec précision. Ce processus est ensuite répété plusieurs fois pour générer l’image. Stefan Hell de l’Institut Max Planck de chimie biophysique a reçu le 10e German Future Prize en 2006 et le prix Nobel de chimie en 2014 pour son développement du microscope STED et des méthodologies associées.[50]

Alternatives[[[[Éditer]

Afin de surmonter les limitations imposées par la limite de diffraction de la lumière visible, d’autres microscopes ont été conçus qui utilisent d’autres ondes.

Il est important de noter que les ondes de fréquence plus élevée ont une interaction limitée avec la matière, par exemple les tissus mous sont relativement transparents aux rayons X, ce qui entraîne des sources de contraste distinctes et des applications cibles différentes.

L’utilisation d’électrons et de rayons X à la place de la lumière permet une résolution beaucoup plus élevée – la longueur d’onde du rayonnement est plus courte, donc la limite de diffraction est plus basse. Pour faire le
Sonde courte longueur d’onde non destructive, le système d’imagerie par faisceau atomique (nanoscope atomique) a été proposé et largement discuté dans la littérature, mais il n’est pas encore compétitif avec les systèmes d’imagerie conventionnels.

STM et AFM sont des techniques de sonde à balayage utilisant une petite sonde qui est balayée sur la surface de l’échantillon. La résolution dans ces cas est limitée par la taille de la sonde ; les techniques de micro-usinage peuvent produire des sondes avec des rayons de pointe de 5 à 10 nm.

De plus, des méthodes telles que la microscopie électronique ou à rayons X utilisent un vide ou un vide partiel, ce qui limite leur utilisation pour les échantillons vivants et biologiques (à l’exception d’un microscope électronique à balayage environnemental). Les chambres d’échantillons nécessaires pour tous ces instruments limitent également la taille de l’échantillon, et la manipulation de l’échantillon est plus difficile. Color cannot be seen in images made by these methods, so some information is lost. They are however, essential when investigating molecular or atomic effects, such as age hardening in aluminium alloys, or the microstructure of polymers.

See also[[[[Éditer]

References[[[[Éditer]

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Cited sources[[[[Éditer]

  • Van Helden, Albert; Dupre, Sven; Van Gent, Rob (2011). The Origins of the Telescope. Amsterdam University Press. ISBN 978-9069846156.

Further reading[[[[Éditer]

  • « Metallographic and Materialographic Specimen Preparation, Light Microscopy, Image Analysis and Hardness Testing », Kay Geels in collaboration with Struers A/S, ASTM International 2006.
  • « Light Microscopy: An ongoing contemporary revolution », Siegfried Weisenburger and Vahid Sandoghdar, arXiv:1412.3255 2014.

External links[[[[Éditer]


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